ספריות דנ"א (DNA Libraries):

• ספרייה גנומית:
  • חותכים את כל הדנא של האורגניזם (כולל אקסונים, אינטרונים ואזורי בקרה) ומכניסים ל וקטורים. הספרייה זהה לחלוטין בכל תא בגוף.
• ספריית cDNA (Complementary DNA):
  • ספריה שמבוססת רק על גנים שמבוטאים בפועל בתא או ברקמה מסוימת באותו רגע.
  • תהליך: מבודדים את ה-mRNA הבוגר מהתא, ומשתמשים באנזים רוורס טרנסקיפטאז כדי לסנתז ממנו דנ"א
  • יתרון קריטי: מכיוון שמבוססת על mRNA בוגר, היא מחוסרת אינטרונים. לכן היא מושלמת לייצור חלבונים אנושיים בתוך חיידקים (שלא יודעים לבצע שחבור/splicing).

היברידיזציה ומיפוי גנים:

• עיקרון ההיברידיזציה:
  • חימום ה-DNA ל-90-95 מעלות מפרק את קשרי המימן ומפריד את הגדילים (דנטורציה).
  • קירור איטי מאפשר לגדילים משלימים להתחבר בחזרה (רנטורציה).
• גלאי - DNA Probe:
  • מקטע חד-גדילי שמתחבר לרצף המשלים שלו.
  • מחברים אליו סמן פלואורסצנטי וכך ניתן לזהות איפה מתבטא גן ספציפי במוח (היברידיזציה באתרה).
• טרנסקריפטומיקה מרחבית (Spatial Transcriptomics):
  • השיטה המתקדמת ביותר כיום.
  • במקום להרוס את הרקמה, חותכים פרוסת מוח ומניחים על זכוכית שעליה מודפסים מיליוניקואורדינטות של X ו-Y.
  • הרנ"א מהתא נדבק לברקוד, ולאחר ריצוף המחשב מרכיב מפה תלת-ממדית שמראה בדיוק איזה גן התבטא ובאיזה מיקום.

אורגניזמים טרנסגניים ומודלים של מחלות:

• למה עכברים?
  • הם דומים לנו גנטית ופיזיולוגית, זולים, ומתרבים מהר. קופים וחזירים בקושי בשימוש בגלל עלויות ובעיות אתיות.
• זני עכברים במעבדה:
  • זן Outbred:
    • עכברים שונים גנטית זה מזה (מחקה אוכלוסייה אנושית).
    • הבעיה: שונות גדולה מקשה על ניסויים.
  • זן Inbred :
    • עכברים שזיווגו אותם במשך מספר רב של דורות, כך שהם זהים גנטית ב-100%.
    • היתרון הוא תוצאות שניתן לשחזר, אך צריך להיזהר מסחף גנטי (מוטציה אקראית שמשתלטת על המושבה ומעוותת את הניסוי).
• מושגי השתקה וביטוי:
  • נוקאאוט:
    • השתקה מוחלטת של גן.
    • החיסרון הוא שאם הגן חיוני, העובר ימות.
  • נוקאאוט עם תנאי:
    • מנגנון המאפשר להשתיק את הגן רק בבגרות או רק ברקמה מסוימת כדי שהעכבר לא ימות כעובר.
• שיטות ליצירת עכבר טרנסגני:
  1. הזרקה לפרונוקלאוס: פשוט אך ה-DNA משתלב בצורה אקראית בגנום.
  2. תאי גזע (ES cells): רקומבינציה הומולוגית מדויקת, אך התהליך ארוך ומורכב מאוד.
  3. שיטת CRISPR-Cas9: חיתוך מדויק ומהיר בעזרת אנזים Cas9 שמונחה על ידי רנא.
• מודלים נפוצים למחלות:
  • מודל NSG / SCID:
    • עכברים עם כשל חיסוני שאין להם דחיית איברים.
    • משמשים להשתלת גידולים אנושיים או רקמות.
  • מודל APP/PS1 (אלצהיימר):
    • עכברים עם שתי מוטציות אנושיות הגורמות להצטברות רעילה של פלאק עמילואידי וליקויים בזיכרון.
    • משמשים לבדיקת תרופות למחלה.

חלבונים פלואורסצנטיים (Fluorescent Proteins):

• חלבון ה-GFP (Green Fluorescent Protein):
  • בודד לראשונה ממדוזה. בעל מבנה ייחודי של צינור בטא (Beta-barrel) שמגן על כרומופור במרכזו.
  • היתרון הגדול שלו הוא שהוא פולט אור ירוק ללא צורך בקופקטורים או באנרגיה מהתא.
• חלבונים כימריים (Chimeric Proteins):
  • ניתן לחבר את הגן של ה-GFP לגן שאנו חוקרים ( קולטני AMPA בסינפסה).
  • התא ניגש לייצר את החלבון וייצר בעצם חלבון מחובר שזורח, מה שמאפשר מעקב בזמן אמת בתאים חיים לראות את הדינמיקה שלהם.
• שיטת Brainbow:
  • שימוש בשילוב של כמה חלבונים פלואורסצנטיים בצבעים שונים כדי לצבוע כל תא עצב במוח בצבע ייחודי, ממש כמו קשת בענן